栎皮酮的微波强化提取技术
李冰 吴建文 李琳 陈玲 胡松青
| 目录 |
| 0 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与讨论 |
| 3 结论 |
摘要： 采用微波技术来强化从洋葱中提出天然抗氧化剂——栎皮酮。考察了微波功率、微波辐射时间、碱液浓度以及溶剂用量对栎皮酮提取率的影响，并且观察了在微波场下洋葱细胞的变化情况，从而探讨微波强化栎皮酮提取过程的机制。
关键词： 栎皮酮，微波，抗氧化剂
近年来研究发现，从洋葱、沙棘和山楂中提取的栎皮酮（ Quercetin ）具有良好的抗氧化能力，是一种很有应用价值的天然抗氧化剂。
栎皮酮为黄色针状结晶性粉末，为溶于水，易溶于碱性水溶液，可溶于乙醇等有机溶剂。他的热稳定性良好，其分解温度为 314 ℃ [1] 。栎皮酮来源广泛，通常存在于各种蔬菜和水果中。目前。常用的提取方法为碱提酸沉法，但这种常规的提取方法效率较低，难以适应工业大生产的要求。关于应用微波强化从植物中提取栎皮酮的研究在国内外还鲜见报道，有鉴于此，本研究拟应用微波强化碱提取发从洋葱中提取栎皮酮，对微波场下洋葱细胞变化情况进行探讨，并从细胞水平考察微波强化提取的内在机制。
1 材料与方法
• 1 材料与设备
新鲜洋葱 市售：氢氧化钠、盐酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、亚油酸、氯化亚铁、硫氢酸氨、均为分析纯试剂：标准栎皮酮 为 SIGMA 公司产品 BHI 为市售食品添加剂。
紫外 — 可见分光光度计 Unico-UV2102PC, 上海 Unico 公司；高效液相色谱仪 Waters 600 型，美国 Waters 公司；微波萃取设备 ETHOS SEL ，意大利 Milestone 公司；显微成相系统 DC300 ，得国 Leica 公司。
• 2 实验方法
• 1 栎皮酮的提取液中栎皮酮浓度的确定。将洗净的新鲜洋葱切成细条，用粉碎机（粉碎机功率 250W, 转速为 2200r/min ）打碎后，在微波辐射下用碱液浸取；然后将提取液抽滤分离得到黄绿色的抽滤液，加入酸并离心沉淀。将此沉淀用 95% 乙醇溶解，配成栎皮酮的乙醇溶液并测量其浓度。
栎皮酮在 200—400nm 范围内有一个最大吸收波长，可用紫外分光光度法（ UV 法）测量栎皮酮的浓度，但是，早洋葱中除了栎皮酮外还有一些类黄酮类化合物的特征吸收峰与栎皮酮的相同，还可能直接导致运用 UV 方法测定的浓度值存在一定误差，而利用高效液色相谱法（ HPLC 法）则不存在这样的问题。然而， HPLC 法样本的预处理麻烦而且费时。因此，有必要采用一种简化而准确的方法确定栎皮酮的浓度。本研究采用 HPLC 校正法，即首先由 UV 法和 HPLC 法分别测量栎皮酮溶液的浓度，然后比较由 UV 法所测的栎皮酮浓度与对应的由 HPLC 法所测的栎皮酮浓度之间的差异，从而得到 HPLC 法对 UV 法测定栎皮酮浓度的校正系数γ，那么，提取液中栎皮酮浓度由下列计算而得：
X= γ× Y/0.2677
式中： X 为栎皮酮溶液的浓度，单位是 mg/100ml,
Y 为 UV 法测得的吸光度值，
• 2677 是 UV 法中栎皮酮标准曲线一元回归方程中的系数，
γ为 HPLC 法对 UV 法的校正系数，γ =0.8844 。
可见，通过（ 1 ）式可直接由 UV 法测得的吸光度值算出栎皮酮的浓度。
• 2 微波场下栎皮酮提取率的计算，栎皮酮的提取率按以下公式计算：
Y=X × 25 × 200/2
式中， Y 为提取率，以 100% 新鲜洋葱提取的栎皮酮的 mg 数表示，单位是 mg/100g 洋葱，系数 2 为所移取溶液量，系数 25 为定容后液体的体积，系数 200 为实验中提取栎皮酮得到的总体积， X 为校正后溶液中栎皮酮的浓度，单位为 mg/100mL 。
1.2.3 洋葱细胞的显微观察 选取经微波提取栎皮酮实验后的洋葱，放于载波片上，滴一滴蒸馏水，将洋葱碎粒尽量平铺在载波片上，尽量不使他们重叠。盖上盖玻片，放在显微成像系统下观察洋葱细胞经过不同条件提取后的细胞结构。显微成像系统的放大倍数为 10 × 20 。
1.2.4 统计分析 进行三次重复实验。为检验不同提取条件下微波对栎皮酮提取率是否有显著性的影响，采用 Matlab6.0 的 t- 检验程序仅仅性单变量统计分析。
2 结果与讨论
2.1 微波功率的确定
在常规提取实验的基础上，采用 ETHOS SEL 微波萃取设备，使用 0.03mol/L,NaOH 溶液，料液比为 1 ： 1.5 （ w/w ）进行提取实验。对样品进行 5min 的微波辐射，测定在不同功率作用下栎皮酮的提取率，得到微波功率和提取率的关系，如图 1 所示。
图 1 微波功率与提取率的关系图
从图 1 可以清楚地看出，在使用 0.03mol/LnaOH 溶液为提取液，料液比（ w/w ）为 1 ： 1.5 的条件下，微波功率的不同导致微波强化效果呈现很大的差异。从实验所选取的微波功率来看，随着功率的增大，微波强化提取效果明显增强。微波功率从 400w 增加到 600w 时，提取率从 38.41mg/100g 洋葱增加到 47.69mg/100g 洋葱。次后，如果继续增大微波功率，提取率没有明显的增加。
在前期的栎皮酮提取研究中已得出 [2] ，常规条件下经过 120min 的提取，提取率为 43.35mg/100g 洋葱。相比之下，在微波场功率为 600w 时候提取 5min ，提取率就达到 47.69mg/100g 洋葱。
在本实验条件下， 600w 是一个从洋葱中提取栎皮酮比较合适的微波辐射功率。
• 2 微波辐射时间的确定
使用实验 2.1 中确定的最适微波功率 600w ，使用 0.03mol/LnaOH 溶液，液料比为 1 ： 1.5 （ w/w ）进行提取实验，改变微波辐射的时间，分别设定为 1.5 ， 3.0 ， 4.5 ， 6.0 ， 8.0 ， 10.0min 。测定在各个微波辐射时间条件下栎皮酮的提取率，可以得到图 2 所示的微波辐射时间和提取率的关系曲线。
图 2 微波辐射时间和提取率的关系曲线
图 2 表明，在 600w 微波功率辐射下，抵挡微波辐射时间从 1.5 min 增加到 6.0 min 时，提取率得到明显的提高；当微波辐射 6.0 min 时，被提取出来的栎皮酮最多，提取率达到最大，为 49.12mg/100g 洋葱。但是如果继续延长微波辐射时间，提取率则有下降的趋势。这可能是因为在 600w 微波输出功率辐射下，提取体系的温度继续升高，温度的升高加速了栎皮酮在碱性条件下的氧化，因此，提取液中栎皮酮的浓度下降，提取率也降低。
由此，在本实验中，微波功率为 600w 的条件下，微波辐射时间为 6.0 min 时的提取效果最适合，提取率达到最高。
2.3 微波强化时碱液浓度的测定
从微波提取实验中知道，碱液的浓度与提取物的浸出有很大的关系，但是如果碱性越强，则作用时间也越长，栎皮酮的氧化作用也越厉害。由此可知，如果不能选择合适的碱液浓度，一方面会导致提取率的降低，另一方面可能导致提取产物纯度的降低。在本实验中，使用的微波强化功率为 600w ，微波辐射时间为 6.0 min ，改变提取液 NaOH 溶液的浓度，进行栎皮酮的提取实验。
选择 0.01 ， 0.02 ， 0.03 ， 0.04mol/L 四个浓度的氢氧化钠溶液作为提取液，测定在不同浓度氢氧化钠溶液条件下的提取率，得到碱液浓度和提取率的关系，见图 3 。
图 3 碱液浓度和提取率的关系
（微波功率 600w ，辐射时间 6.0min
由图 3 可以看出，在微波强化功率为 600w ，微波强化提取时间为 6.0 min 的条件下， NaOH 溶液的浓度为 0.02mol/L 时，提取率比用 0.01mol/L 时提高很多，随着碱液浓度的继续增大，提取率却有所下降。这可能是由于在微波辐射下，提取体系的温度上升得很快，如果碱液浓度太大，无疑将更加速栎皮酮的氧化。
由此可知，在 600w 微波强化 6.0 min 时间条件下，从洋葱中提取栎皮酮， 0.02mol/L 的碱液浓度比较合适。
2.4 微波辐射时溶剂量的确定
在洋葱量一定时，加入不同量的碱液进行提取。比较溶剂使用量不同，即料液比不同对提取率的影响，结果见图 4 。
图 4 料液比和提取率的关系
由图 4 可见，在微波强化功率为 600w ，微波辐射时间为 6.0 min ， NaOH 溶液的浓度为 0.02mol/L 的条件下，溶剂量对浸取效果和提取率有一定的影响。当料液比为 1 ： 1.5 和 1 ： 2 时，实验中栎皮酮的提取率均大大高于料液比为 1 ： 1 时的提前率。经 t- 检验，在料液比为 1 ： 1.5 和 1 ： 2 时，栎皮酮的提取率差别不大（ p<0.05 ）。
由此可知，在本实验条件下，当 600w 微波强化提取 6.0 min ， NaOH 溶液的浓度为 0.02mol/L 时，综合考虑各项指标可以认为，洋葱和 NaOH 溶液的料液比为 1 ： 1.5 时哦比较合适。
2.5 显微观察提取实验前后的洋葱细胞的变化
从上面所做的实验可以看出，微波辐射可有效的强化从洋葱细胞中提取栎皮酮，如能从细胞水平了解在微波场下洋葱细胞变化的情况，则有助于解释微波强化从植物细胞中提取有效成分的机制。因此，本研究利用显微成像系统观察不同微波功率下洋葱细胞的变化情况，并与新鲜的洋葱细胞及常规方法处理的洋葱细胞比较，从而探讨微波对植物细胞作用的机理。图 5— 图 9 是在相同放大倍数（ 10 × 20 ）下洋葱细胞的显微照片。
由图 5 可以看出，新鲜的洋葱细胞完好，具有较厚的细胞壁，与图 6— 图 9 的细胞相比，新鲜洋葱细胞显得比较饱满。
由图 6 可以看出，虽然 NaOH 浸提后的洋葱细胞壁保存完好，没有很大变化，但是与新鲜洋葱细胞相比有所缩小，这可能是因为经过碱液长时间的浸泡，洋葱细胞内的很多物质已经被浸出，使用洋葱细胞收缩。
由图 7— 图 9 可以看出，微波功率的大小对洋葱细胞在提取过程中所发生的变化有着很大的影响。虽然微波辐射的时间只有几分钟，但细胞本身发生着显著的变化，随着微波功率的增加，细胞壁则变的越来越薄，这是由于微波的热作用使细胞膜热膨胀而变薄。此外，由于细胞内物质向细胞外的溶剂浸出，细胞体积有所变小。当不断施加微波时细胞内的蒸汽压不断增大，当足够大时就会把细胞涨裂，由图 9 可见，当微波功率达到 800W 时候，细胞膜已经破裂，这时会有更多的栎皮酮浸出，但是洋葱细胞内的其他物质的浸出也增多了，反而增加了随后纯化步骤的负担，所以，本研究中微波功率选择为 600w
3.结论
显然，微波强化作用是提高 栎皮酮提取率的一个切实有效的方法，在微波强化条件下的提取率比常规条件下的提取率提高了近 1/4 。因此，充分利用我国丰富的洋葱资源，运用微波强化提取技术，从洋葱中提取具有高附加值的栎皮酮，不仅为农产品的深加工寻找出一条崭新的途径，而且可以促进我国开发天然食品抗氧化剂的发展前景。
参考文献
• 凌天庭。天然抗氧化剂极其消除氧自由基的进展 [J]. 食品工业， 2000 ，（ 3 ）： 19~22
吴建文。洋葱中栎皮酮的提取技术及其抗氧化性能的研究（硕士论文） [D] 华南理工大学 2003.
